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標靶蛋白質體技術介紹―多重反應監測之蛋白質定量質譜法
第137期-標靶蛋白質體技術介紹―多重反應監測之蛋白質定量質譜法

標靶蛋白質體技術介紹―多重反應監測之蛋白質定量質譜法

生物醫學系/分子醫學中心 陳怡婷助理教授

找尋與驗證疾病生物標誌分子以及未來臨床應用,為長庚體系重點研究發展方向之一。而利用體學技術找尋生物標誌(Biomarker)之研究工作,經由長庚醫院與 本校多位同仁數年的合作研究,目前已經獲得許多新穎的生物標誌候選蛋白質分子,正等待進一步有效驗證。傳統的 ELISA 驗證方法需要依賴抗體,然而許多新穎蛋白質缺乏抗體,而無法有效驗證;因此「高通量及多重定量」之驗證技術平台,將是世界潮流趨勢。目前學界急欲發展的解決方案,是使用藥廠常用於小分子定量之儀器-液相層析串聯式四極桿質譜儀之多重反應監測(Multiple reaction monitoring, MRM)模式作為驗證平台;此方法不需要使用抗體,即可針對生物樣品內中高含量之蛋白質進行定量工作,對於較微量的樣品,亦可使用一胜肽抗體純化目標蛋白質序列,具有優良之線性範圍及再現性,十分適合做為發展新穎蛋白質生物標誌所需之大量樣品 的驗證工具。

三段四極桿串聯質譜儀(triple quadrupole tandem mass spectrometry)(圖1)主要元件,為串連三個高真空狀態的四極桿質譜儀 (quadrupole mass spectrometry)(圖2,Q1, Q2 及 Q3),離子源產生離子後經過三段四極桿(triple quadrupole)篩選後,進入偵測器以偵測訊號。第一段及第三段質譜可用於選擇離子檢測(ion selection)或全掃描(Full scan)。利用切換第一段及第三段四極串聯質譜之掃瞄偵測模式,可以進行特定分子量之母代離子掃描(Precursor ion scan),特定分子量之子代離子掃描(Product ion scan),中性碎片丟失掃描(Neutral loss scan),及多重反應監測(Multiple reaction monitoring, MRM),可用於蛋白質身分鑑定及定量;此種驗證不需要抗體即可完成,但是需要加入特定「穩定同位素標定之胜肽標準品」(stable isotope-labeled peptide standards)作為蛋白質身分鑑定及定量之基準,這些標準品可由胜肽合成儀合成,取得相當容易,可擴展至新穎蛋白質生物標誌分子,而不再受限於抗體的取得。

進一步說明多重反應監測操作模式如圖 2,不同荷質比的離子(m1, m2, m3, m4, m5)經過第一段四極桿的篩選(Single Mass Ttransmission)後,只允許和分析物有關的離子(m3)通過,再利用第二段四極桿(Collision Chamber)把該離子打碎,最後再利用第三段四極桿(Mass Scan Mode)只偵測特性二次離子 m3p。由於特性二次離子具有很高的選擇性,可以有效的消除干擾,並提供分析物鑑定資料;此外由於空間串聯設計的結果使三段四極桿液相層析串聯質譜儀可以提高離子掃瞄的速度,改善靈敏度及重現性,一般可達到每次樣品分析至少可監測 300-600 對以上的離子對,若每六個離子對對應一蛋白質,即表示一次質譜分析可以定量 50-100 個蛋白質。搭配同位素標定標準品可以達到快速絕對定量多種胜肽/蛋白質之功能。本儀器可應用的範圍非常廣;舉凡農藥殘留、動物用藥殘留、蛋白質體分析以及各類化合物分析與確認皆可應用。

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