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研究過程的提問—以抗血栓藥物研發為例

 

研究過程的提問-以抗血栓藥物研發為例
 

 

生化生醫所 蔡少偉教授

在老師指導學生進行研究過程中,總是隨時耳提面命,要求學生必須先培養提問的能力,亦即不管是閱讀他人的論文或是檢視自我的實驗數據時,必須先心存質疑的態度,然後透過思慮與提問,以及提出可能的解答。即使暫時無解決之道,只要這些問題如影隨形盤旋在腦海中,自然就會隨時產生聯想,最後可能豁然開朗獲得解答,成為研究過程中的小確幸

過去數年本人實驗室嘗試利用具立體選擇性絲胺酸型水解酶(包含酯解酶、脂肪分解酶、絲酸型蛋白質分解酶),開發前對掌性異構物 (prochiral compounds) 之去對稱化 (desymmetrization) 或外消旋物 (racemates) 的動力分割 (kinetic resolution) 製程。在目標產品以及擬進行催化基質的官能基確定後,就會依據酵素工程 (enzyme engineering) 包括酵素來源篩選、前處理與固定化、其來源基因之定點突變、多點突變、或定向演化等、介質工程 (medium engineering) 包括影響反應之環境因素,如:溫度、溶劑、pH 值、抑制劑等、以及基質工程 (substrate engineering) 包括各種基質衍生物等三個方向思考可能使用的變因,以期能夠提高酵素表現(即選擇性、反應性、與穩定性)。可惜的是,到目前為止尚無一套有效的策略能夠定量(甚或只有定性)預測酵素行為;因此初步的酵素來源、反應條件與基質型態的篩選乃屬必要。此外,酵素的催化原理與相關有機化學反應的基本知識,仍然是不能輕易忽略的,因為它們可能就是提供解答的關鍵

就以抗血小板凝集劑 Clopedogrel 的前驅物 (R)-2-chloromandelate  為例,進行其外消旋基質的酯解酶水解動力分割如圖一),在初步篩選酵素來源 (K. oxytoca esterase  )、兩相反應系統異辛烷 = 6:1  v/v、反應溫度  (55oC)  後,應用基質工程的概念以不同離去能力醇基的酯類衍生物為基質,由動力學分析獲得圖二的結果。圖中 k2R/KmRk2S/KmS   E= (k2S/KmS)/(k2R/KmR) 分別代表 (R)- 型基質、(S)- 型基質的反應性、以及酵素立體選擇性。離去基 R2 基團的誘導參數越大代表其愈容易水解離去,所以 (R)-  型與 (S)- 型基質的反應性皆能提升,且 E >1  並隨之增加。但是當誘導參數超過 0.03 時,反應快的 (S)- 型基質的反應速率增加幅度卻較  (R)-  型基質慢,致使立體選擇性 E 下降而得到最大值。

                有了這些結果後,接下來的提問就是:

一、為何酵素有與非酵素觸媒(如 OH-  )類似之催化行為?能否從酵素催化機構來說明此現象?

二、能否找到更適合的離去基,使得誘導參數增加時,反應快的(S)-型基質的反應速率的增加幅度不會慢下來,因此酵素的立體選擇性也能夠隨之提高?

三、上述的結果能否擴展至其他絲胺酸型水解酶?

這些問題是否能夠獲得解答,甚至進而開發具有產業競爭力的酵素製程?當然一切要仰賴持續不斷的嘗試與努力,再加上一點上天的恩寵了。(持續閱讀 Adv. Syn. Cat., 351, 2333-2341, 2009)
 

    
 R1: 2-Cl-Ph;
 R2: (1) CF3, (2) CH2OCH3, (3) CH2OC2H5, (4) H, (5) CH3,
(6) (CH2)4CH3, (7) CH2Si(CH3)3

圖一:兩相系統中,外消旋 (R,S)-2-chloromandelates 的水解動力分割。

R2

誘導參數

(1)

 0.38

(2)

 0.13

(3)

 0.11

(4)

 0.03

(5)

 0.01

(6)

- 0.01

(7)

- 0.09

    ▲圖二:(○)log(k2R/KmR)、(●)log(k2S/KmS)
      、(■)
log(E)隨R2基團誘導參數之變化。
      (參考文獻
Biotechnol. Bioeng.,98,30-38, 2007)

R2基團的誘導參數(inductive parameter  

 

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