Your browser does not support JavaScript!
年份期數

Recent

數據載入中...
奈升級線上多維液相層析質譜技術於蛋白質體分析之應用

 

奈升級線上多維液相層析質譜技術於蛋白質體分析之應用

生化科 簡昆鎰助理教授

近年來蛋白質體學已經被廣泛的應用在腫瘤生物標幟的找尋及其他基礎生物醫學領域研究。蛋白質體學之所以能夠蓬勃發展,其中最重要的關鍵在於質譜儀設備的快速升級,以質譜儀分析取代傳統的艾德曼胜肽胺基酸定序 ( Edman sequencing ),使得蛋白質鑑定的效能廣泛的提升,進而使整體蛋白質體的分析得以進行。以液相層析質譜學為根基的鳥槍式 ( shotgun ) 胜肽鑑定技術,是目前蛋白質體分析的主流。運用優異的胜肽分離系統搭配掃瞄速度快的質譜儀,數萬條胜肽對應數千個蛋白質可在幾個小時內鑑定完成。有趣的是,儘管利用同樣的質譜儀分析類似的樣品,不同的實驗室之蛋白質體鑑定的成果相差卻是十分懸 殊。其中的一個重要原因即是對液相層析系統的運用及胜肽特質的掌握能力不同所致。惟有提高胜肽的回收率及分離效能,才能獲得最佳的分析成果。

受限於蛋白質樣品的總量,尤其是臨床樣品,現今的液相層析均採用低流量奈升級 ( nano liter scale ) 的系統,以提高靈敏度。當流量減低至奈升級時,進樣速度及接管之間的多餘體積,均會影響數據取得的時間及分離效能。因此研究者通常會使用微小的捕捉管柱 ( trap column ),使樣品能以較高的流速進樣,並停留在捕捉管柱中,再透過多孔閥的切換,將之與逆相 ( reverse phase ) 層析分析管柱連結,進而大幅提高樣品分析的速度,並保有管柱的分離能力。由於質譜儀運作時,是採用巧妙的訊息導向之數據取得方式 ( information dependent data acquisition,IDA ),訊號強 ( 含量較高 ) 的胜肽分子將優先進行分析,如果胜肽分離效能不彰,微量分子與高含量分子同時析出,則微量分子被鑑定到的機會就會大幅降低。

針對高複雜度樣品,二維液相層析是最常為人採用的策略。其作法是利用不同分離原理 ( 例如:離子交換法 ) 將樣品進行第一維的分離,將所得的 30-60 個組份 ( fraction ),個別以第二維液相層析串聯質譜儀進行分析,如此整體的分離效能可以提高數十倍。本實驗室主要的工作在於建立高效能的線上多維胜肽分離系統,以提高樣品的回收率,進而提昇質譜鑑定能力。由於上述二維液相層析中不同維度分離所使用的沖提液系統不盡相容,因此我們設計了一套線上稀釋的裝置,將第一維管柱析出之溶液,以水 ( 與第二維逆相層析法相容 ) 進行高倍率稀釋,再導入捕捉管柱進行樣品淨化的工作 ( 除鹽 )。為使分離工作不需間斷,十孔閥裝置 2 支捕捉管柱,其中一支進行捕捉的同時,另一支則串聯至分析管柱進行質譜分析。當每次第一維分離組份完成時,十孔閥即進行切換,使捕捉管柱的角色互換,如此即可達到最高的時間利用效率 ( 如圖一 )

此系統建構完成後,幾乎任何分離方法皆可搭配成二維分離系統。目前我們已經測試了以陽離子交換法、陰離子交換法以及鹼性逆相層析法做為第一維分離策略,皆可順利地與第二維酸性逆相層析法搭配。利用這樣的系統我們可以從 250 ng 的細胞萃取蛋白樣品中鑑定到 2249 個蛋白質,其中 1604 個蛋白質至少鑑定到 2 段胜肽。除了針對微量樣品,我們也可依據蛋白進樣量調整第一維分離之組份數及總分析時間,以達到最高的蛋白鑑定效能。

未來我們期許此系統搭配高感度質譜儀分析,能夠像 DNA 微陣列技術一樣,發展出「胜肽液相層析微陣列」的技術,使蛋白質體學分析的宏觀度、靈敏度及可信度均更上一層樓。

▲圖一:奈升級線上多維液相層析系統

 

瀏覽數  
  • 轉寄親友
  • 友善列印
  • 新增到收藏夾
  • 分享
將此文章推薦給親友
請輸入此驗證碼
Voice Play
更換驗證碼