三維電子顯微影像重建-愛因斯坦醫學院休假研究紀實

解剖科 柳文卿 副教授

　　在解剖科教學人力長年吃緊的情況下，我有幸地獲得在 2010 年休假的機會，得以回到三十年前開啓我學術生涯的美國，進行長達八個月的客座研究工作。行前我參加了白浪冒險學校在烏來的溯溪活動，被帶到約有五層樓高的斷崖邊，自行決定是否跳下。那不到三秒鐘自由落體的經歷，覆蓋了先前躊躇煎熬的記憶。對年過半百、學術工作面臨極大困境的我，此行正如丹麥哲學家祁克果所言，是”信心的一躍”。

　　參訪的紐約阿伯特愛因斯坦醫學院 ( Albert Einstein College of Medicine )，位於紐約市布朗區隸屬於猶太人所創辦的耶西華大學 ( Yeshiva University )。自 2008 年起，它的新院訓是：“Science at the Heart of medicine”( 科學心繫醫學 )。又因為它是唯一經愛因斯坦本人同意，以其為名的機構，所以在院區內有不少他的名言雋刻，例如：Anyone who has never made a mistake has never tried anything new. ( 未曾犯下任何錯誤的人，即是未曾嚐試任何新事物的人。)Imagination is more important than knowledge. Knowledge is limited. Imagination Encircles the world. ( 想像力比知識重要，知識受限於想像力所界定的範疇。) 這些語錄，提示著勇敢創新的精神，對航向未知的研究人員，給予無比的信心與鼓勵。

　　愛因斯坦醫學院僅提供研究所學程，以培育臨床及醫學研究人才為主。入學人數每年不到三百，卻有三百個研究實驗室，師生比高達 3.3：1。所有獲得入學許可的研究生，學費全免，並有每年三萬美金的津貼。然而，愛因斯坦醫學院所誇耀的卻是它的教師行列。在開辦之初，紐約時報即預言：「以其傑出之師資陣容，必可確保該學院在世界之偉大醫學院名單裡，佔有一席之地」。時至今日，院長在寫給新進教師的聘任信中，仍再次強調：「自 1955 年創院以來，本院最獨特的強項就是師資」對教師的重視，不只是口號而已，它有教師發展中心 ( office of faculty development ) 的編制，循環舉辦各樣實用的課程，並保證新進教師有研究經費的補助。還有博士級的行政人員，輔助對外各項校外計劃之申請，林林總總，對教師專業的培育可謂相當用心。猶太人向來給人刁鑽吝嗇的感覺，但是這種「既要馬兒跑，就給馬兒吃得飽」的策略，修正了我偏差的看法。

　　我所參與的研究室位於神經科學所，稱線蟲解剖中心，主持人為 Dr. David H. Hall。美國國衞院給予他科學教育類的經費，建構了兩個網站：其一為線蟲圖譜 http：//www.wormatlas.org 是所有想要了解線蟲構造的人，必會造訪的網站。其二是線蟲影像資料庫 http：//www.wormimage.org，它將早期線蟲研究者所累積的珍貴連續切片照片數位化，成為公開的科研資產。然而，能夠將這些二維影像，堆疊於腦中，重建其三度空間全貌者，大概只有 David Hall 一人。有效地傳遞三度空間的知識，必須藉助描圖及模型建構。拜電腦繪圖能力不斷提昇之賜，目前已可用視覺化軟體來重建。該實驗室近年來則針對帶有基因改造之線蟲株做形態學的分析。改採高壓急速冷凍方式製備樣品，配合後續的電子顯微鏡三維斷層顯像術 ( electron microscope tomography )。以下就二者在線蟲解剖上之應用作簡單的介紹。

　　線蟲是被廣泛使用的一種模式生物，由於其外殼有幾丁質包裹，和植物細胞類似，不容易用液體滲透的方式加以固定。近年來所發展出來的急速冷凍技術，則可以解決這個問題。所謂高壓急速冷凍法，就是在兩千個大氣壓力下，施加液態氮，使生物樣品瞬間固定，其內所含的水分子，也可在這個急速冷凍的狀況下，直接轉換成玻璃冰 ( vitrified ice )，避免體積較大的立體冰晶 ( cubic ice ) 產生，傷害到組織。線蟲的長度 1 毫米、直徑 60 微米。這個尺度，容許全蟲固定。而後製的橫斷切面，也可以完整納入電子顯微鏡的視野，不必縫接，可謂恰到好處。

　　一般而言，生物樣品切片，使用穿透式電子顯微鏡觀察，其解析度在一個奈米上下。這個數字指的是 X 和 Y 軸方向的解析度。至於 Z 軸方向的解析度，就取決於切片的厚度了，它大致介於 30-100 奈米之間。然而，電子顯微鏡的景深在微米的範圍，也就是切片厚度的十倍以上。所有包含在切片之內的構造，均以堆疊 ( superimpostion ) 的方式投射成二維影像。對於比切片厚度還要小的構造，例如細胞囊泡的融合點，則無法得知其 Z- 軸方向的正確位置。今將三維斷層顯像 ( tomography ) 技術應用在線蟲上，可大大提昇其切片樣品在 Z- 軸方向的解析度。它的做法是收集一系列試片在  ±70° 之間傾斜的投影，共計約百餘張的影像，利用電腦進行比對、校正、 補償、重組。得到一組在 Z- 軸方向，每隔 3 奈米的連續斷層切片 ( virtual serial sections ) 影像；之後交給具有判讀能力的研究者，進行標誌 ( segmentation )。其中影像收集的部份最為關鍵，雖然儀器商可以提供軟體，但實際上的運作，對僅有生物背景的研究人員而言，仍有當高的門檻。

　　下圖為線蟲雙器指狀細胞的三維模型，係建構自 15 片的 250 奈米實體切片，含 1256 層斷層切片，總長 3.75 微米，由副研究員 Ken Nguyen 製備樣品，於紐約結構生物學中心 ( New York Structural Biology Center http：//www.nysbc.org/ )，在 Dr. William Rice 協助之下，取得的三維斷層影像，加以重建標誌而成的，在此一併誌謝。