環境因子對唾液鏈球菌尿素酶表現的分子分析~

一個細菌如何應變生長環境挑戰的例子

微免科　陳怡原副教授

　　蛀牙幾乎是每一個人都曾經歷過的感染，而世人每年花費在治療蛀牙的資源及財力，也頗為驚人。蛀牙的形成與牙菌斑成員能在糖解過程產生酸性化學物質的多寡有直接關係。因過量的酸是導致牙齒珐琅質被侵蝕的主因，口腔內所含的鹼是抗衡蛀牙形成最主要的因子，也由於尿素是唾液中含量豐富的氮源 ( 正常人唾液中尿素含量約在 1-10 mm)，尿素水解一般視為口腔內最主要鹼的來源。由尿素水解所產生的阿摩尼亞，不單可以中和酸性化學物，防止珐琅質流失，並能保持一個較近於中性的牙菌斑生態，所以尿素酶含量的多寡，與口腔健康有著密切的關係。

　　在所有已知口腔菌種中，只有少數菌株具有尿素酶，其中菌數最高且具穩定尿素酶表現型的就是唾液鏈球菌。實驗結果已得知：尿素酶的存在不單可以幫助唾液鏈球菌抗衡酸性環境，由尿素水解所產生的銨 ( NH₄⁺ ) 也可作為唾液鏈球菌生長所需的氮源，故尿素酶對唾液鏈球菌的生存競爭力有極顯著的貢獻。動物模式研究結果也已證實，尿素酶的表現可降低蛀牙形成的機率。唾液鏈球菌的尿素酶與其他細菌尿素酶相仿，均含鎳離子，並由三個不同之次單元體共同組成。

　　在合成一具活性之尿素酶的過程中，需多個蛋白質的共同參與，而唾液鏈球菌製作這些蛋白質的基因，是聚集在一起，呈一尿素酶基因單元 ( urease operon )。此基因單元所製作出的蛋白質，不單包含尿素酶次單元體及組合完整尿素酶全酶所需之輔助蛋白質，同時也具一可攝取尿素的運輸蛋白質及一利用 ATP 為運輸能量的鎳離子運輸系統。整體尿素酶基因單元的表現及各個蛋白質的相對含量，可因生長環境酸鹼度的不同而異。在中性環境下尿素酶的表現，幾乎是完全被抑制的，一旦環境的 pH 值低於 7.0，尿素酶的表現即被大量引發。為了解此一酸鹼調控的機制，本實驗室利用各種分生技術，現已知此一對酸鹼的反應，最主要是由位於尿素酶基因單元上游之啟動子 ( promoter )  的轉錄效率來調控。為分析尿素酶啟動子如何感應酸鹼，我們利用氯胺醇乙醯移轉酶基因  ( chloramphenicol acetyltransferase , cat )  reporter system  建構了完整的尿素酶啟動子及其衍生物與氯胺醇乙醯移轉酶基因的融合體  ( promoter- cat fusions )，並利用一新近設計的嵌入媒介體 ( integration vector )，將所有融合體成功地建立在唾液鏈球菌的 lacZ 基因上。

　　在觀察各個所得之合成細菌種 ( recombinant strains )，在中性及酸性培養環境下所具之氯胺醇乙醯活性，我們發現：緊接在 -35 元素上游的 21個去氧核糖核酸基，在中性環境下對尿素酶啟動子轉錄的抑制效應具有最顯著的影響；而位於 -35元素上游的 39個去氧核醣核酸基群中 ( -57 至 -95 )，則含有對於尿素酶啟動子轉錄所必有的去氧核糖核酸序列。實驗結果也顯示：在 -96 至 -115 的區域內，極可能含有一個潛在、次要的抑制蛋白質目標點 ( repressor binding site )。為了要進一步分析尿素酶啟動子的 cis- acting 因子，我們運用定點突變技術，改變了位於主要抑制蛋白質目標點區域中的二個含有 AT 重覆序列的去氧核糖核酸片段。其中之一，唾液鏈球菌種 M1，在緊接 -35 元素上游的 AT重覆序列內，含有 5 個替代的去氧核糖核酸基；在中性環境下比野生株融合體 ( wild - type promoter - cat ) 的氯胺醇乙醯移轉酶的活性要高過 20倍。

　　同時，M1對酸鹼度的敏感性大為減弱，所以證明這一段去氧核糖核酸序列，對於尿素酶啟動子的正常轉錄，有極重要的影響。針對分析 -52 到 -96 區域的功能，我們利用 M1作為基礎種，在這一區域內設計了 3個刪除衍生物 ( deletion derivatives )，其中每個衍生物各缺少 15或 16個去氧核糖核酸基。實驗結果發現，刪除這個區域內任何片段去氧核糖核酸，會導致顯著減弱氯胺醇乙醯移轉酶的表現；證實這一段去氧核糖核酸含有尿素酶啟動子完全表現的必要序列。由以上分析結果可知多個因子可能同時參與尿素酶表現的調控。運用相同的技術，所有合成的啟動子 -cat 融合體，同時也傳入一個不具尿素酶的口腔鏈球菌中 ( Streptococcus gordonii )，並建立在其 gtfG 基因上。實驗結果顯示：在 S. gordonii內，中性酸鹼度也能抑制尿素酶啟動子轉錄；而其它定點突變及刪除衍生物在 S. gordonii 的表現，與在唾液鏈球菌的表現大致相仿。因此，在尿素酶啟動子內對酸鹼度反應有關的 cis - elements，極可能參與多項鏈球菌基因表現的調節機構 ( global regulatory circuit )。

　　由於鎳離子是合成尿素酶所必須的金屬離子，我們也進一步探討鎳離子濃度對尿素酶活性的影響。我們發現鎳離子濃度本身，並不能影響尿素酶啟動子轉錄效率；但尿素酶在中性抑制環境下的產量，可因外加鎳離子而提升；而增加的活性量隨著鎳離子的量增加而增加。由此可見，為避免在中性環境下產生過量的尿素酶，因而導致環境的鹼化，唾液鏈球菌同時以控制細胞內鎳離子的含量，來控制尿素酶活性的總量；而這一調控模式，讓唾液鏈球菌能迅速並適量地反應環境的改變。

　　人類的口腔對寄生在其內的微生物而言，可說是一千變萬化的生長環境。不論是養份的多寡、溫度或酸鹼度，都會隨著寄主的進食與否而改變。口腔細菌如何精密地調控其基因表現，以應付種種不備而來的挑戰，是細菌成功地在口腔內生存的重要原因。以尿素酶為例：唾液鏈球菌成功地以基因單位轉錄效率及適時地合成適量尿素全酶，來控制尿素酶在不同酸鹼下的總量。這種精密的調控，可使唾液鏈球菌不因環境過度酸化而亡，也不會因合成過量尿素酶，進而過度鹼化生長環境導致生理失調。這樣的特性不單讓唾液鏈球菌能成功地在口腔內與其他牙菌斑細菌競爭，也順帶地降低了產生蛀牙的機率。