胚胎幹細胞在人工肝臟的應用研究

臨床醫學研究所 蕭長春 副教授

　　對於急性肝衰竭的病患來說，「換肝」是目前醫學界公認最佳的治療方法。然而，肝臟捐贈者的人數有限；因此，許多病患在等待換肝的過程中死亡。為了解決肝臟捐贈不足的問題，早在 1958 年便有人提出「人工肝臟」的構想，期望能以這樣的輔助裝置，幫助病患支撐到換肝手術，或是等待病人自行復原。目前用於人工肝臟開發的肝臟細胞有初代動物肝臟細胞、人類不朽化肝臟細胞株和人類肝臟腫瘤細胞株。理論上，一個人工肝臟至少需要填裝 150 克的肝細胞，這相當於 150 億個肝細胞或 1/10 的肝臟。因此，是否能取得足夠的人類肝細胞是人工肝臟開發的關鍵。在目前，要取得這麼多的人類肝細胞只有兩種方法，就是大量培養不朽化人類肝細胞株、使用人類胚胎幹細胞( embryonic stem cells )。

　　胚胎幹細胞是取自囊胚時期的胚胎，比起取自成體的幹細胞更為原始、更為年輕；因此，胚胎幹細胞具有不斷再生和多潛能分化的能力，可大量增殖並分化成人體內兩百多種成體細胞。近年來的研究指出，在體外培養過程中，可將胚胎幹細胞誘導分化成為肝臟細胞。已有許多證據指出，胚胎幹細胞所產生的肝臟細胞具有成熟的特徵，例如：它們具有 Indocyanine green 的吸收能力、P450 基因表現和 P450 功能表現。在動物實驗上，亦證實這種從胚胎幹細胞獲得的肝臟細胞，具有治療急性肝衰竭的效果，而且不會發生畸胎瘤的問題。要讓胚胎幹細胞分化成為肝臟細胞的過程中，培養「胚體( Embryoid bodies )」是必要的程序，然而傳統的胚體培養方法如常見的懸滴法( Hanging drops )和靜置懸浮培養法，都不適合用來大量生產胚體來獲得足夠的肝細胞。為了解決此一瓶頸，我們利用攪拌式生物反應器，成功開發出生產具有肝分化能力的胚體的生產方法。將胚胎幹細胞接種到攪拌式生物反應器之後，經過一天之後胚胎幹細胞就能形成胚體，並且在培養過程中增大體積。將培養 4 天的胚體取出並接種到已披覆 Collagen type I  的培養盤上，再經過生長激素的誘導過程，便能夠促進胚體的肝分化。而且攪拌式生物反應器所生產的胚體與懸滴法所生產的胚體，在白蛋白分泌上相似，在肝基因表現上也相似。所以，我們所發展的胚體量產方法，將可以取代過去的懸滴法，而能用來進一步量產肝譜系細胞。研究成果已發表在BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY, 2007; 71: 728-734.為了能夠以人工肝臟或肝臟細胞移植來治療肝病患者，採用具有高肝功能的胚胎幹細胞分化成的肝譜系細胞，必定能帶來較好的治療效果。基於此目的，我們已研究出一種適合胚胎幹細胞肝分化的培養液，以用來將胚胎幹細胞誘導分化成高肝功能的肝譜系細胞，這種培養液只有在胚胎幹細胞分化第 5 到 7 天時才最具有促進白蛋白分泌的效果。為了研究是哪些因子影響分化細胞的白蛋白分泌能力，我們採用二階全因子實驗設計法，最後找出是培養液中的 Dexamethasone、Insulin 和 Transferrin 能夠促進分化細胞產生白蛋白，其中又以 Dexamethasone 的影響最為顯著。為了證實這些能夠分泌白蛋白的細胞是肝譜系細胞，我們利用 Indocyanine green ( ICG )染色與白蛋白免疫染色進行雙重染色，發現能夠吸收 ICG 染色區域同樣也具有白蛋白表現，因此能證實這些能夠分泌白蛋白的細胞是肝譜系細胞。我們也量測出白蛋白陽性細胞的白蛋白產率為 1.90 ± 0.198 pg/ h·cell，此數據已大幅超越前人所發表的數據。另外，我們經由 RT-PCR 的分析，發現胚胎幹細胞經過我們修訂過的培養方法所分化出來的細胞，具有肝基因表現，如：α1-anti-trypsin、α-fetoprotein、albumin、carbamoyl-phosphate synthetase 1、cytochrome P450 7A1、glucose-6-phosphatase、tyrosine aminotransferase、tryptophan 2,3-dioxygenase 和 transthyretin。此一研究成果將可應用於未來在開發胚胎幹細胞生產高白蛋白產率的肝譜系細胞，以供人工肝臟研究之用。研究成果已發表在BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, 2008 ; 39 : 435-442 ( SCI, rank Top 16% in Chemical Engineering category ).

　　人工肝臟的發展已經將近 50 年，然而到目前為止，仍無令人振奮的臨床研究成果。影響人工肝臟發展的關鍵，就在於如何能夠獲得來源穩定、數量充足，以及具有正常肝功能的人類肝細胞；而利用幹細胞來獲得人類肝細胞，已成為人工肝臟開發成功與否的一線希望。我們期望能在不久的將來解決肝細胞的生產瓶頸，到那時，培養人類肝細胞的人工肝臟，將可望順利進入臨床實驗。從我國肝病比率向來遠高於歐美國家的情況來看，發展這套人工肝臟輔助系統，有其必要性，而且深具意義。