應用關節腔注射玻尿酸治療退化性關節炎的基礎與研究

分生科　游佳融助理教授

一. 退化性關節炎：

　　退化性關節炎 (osteoarthritis）為關節炎中常見的一種，也是老年人最常見的慢性疾病之一，罹患此關節病變的機率已證實與年齡的增長有直接的關聯性。退化性關節炎的特徵為關節軟骨產生漸進式退化，以及關節周邊骨骼的重建，因而造成關節疼痛及功能喪失。在正常的軟骨中，基質 ( matrix ) 的合成與降解是平衡的；但是在退化性關節炎的軟骨中，降解則大於合成。這種平衡會受年齡所影響，且受滑膜與軟骨細胞所產生的多種因子所調控，包括：細胞激素 ( cytokine )、生長因子( growth factor )、蛋白聚醣酶( aggrecanases )及基質金屬蛋白酶 ( matrix metalloproteinase, MMPs ) 等。罹患退化性關節炎可能對病人的生活有多方面的影響，例如：社交活動、社會經濟能力、體態及情緒反應等。臨床上，由於退化性關節炎的損害通常是不可逆的，因此治療退化性關節炎的目的是盡量減緩疼痛，防止或延緩退化，使損害的關節可接近正常功能。治療方式包括：局部止痛劑 (如  capsaicin, methylsalicylate )、全身止痛劑 ( 如 paracetamol, NSAIDs, cyclo-oxygenase- 2- specific inhibitors, glucosamine 及 chondroitin )、關節鏡 ( arthroscopy )、關節腔內注射玻尿酸 ( intra-articular injection of hyaluronic acid ) 以及置換人工關節等。

二、 玻尿酸與退化性關節炎：

　　玻尿酸 ( hyaluronan/hyaluronic acid, HA ) 為關節軟骨細胞外基質 ( extracellular matrix ) 的成分。它是由 N-acetylglucosamine 及 glucuronic acid 所組成的長鏈多醣分子。玻尿酸是哺乳動物組織中含量最豐富的醣胺多醣 ( glycosaminoglycan )，且在結締組織、皮膚、眼球水晶體、軟骨及臍帶中濃度相當高，其中最大的儲存囊為動關節的關節液 ( synovial fluid ) ，其濃度高達 0.5-4 mg/ml。在關節腔內，主要由關節滑膜 B 型細胞負責合成玻尿酸，分子量的大小隨著關節的位置與種類而不同，範圍在 2000-10000 kDa。玻尿酸的硬度會隨分子量降低而減弱，高度純化的玻尿酸會與各種 phospholipids 結合，例如：proinflammatory platelet activating factor，而這些玻尿酸的分子特性，可能與造成退化性關節炎的作用機制有重要的關係。另有研究指出，高分子量的玻尿酸 ( HMW-HA ) 注射到關節腔會附著到關節軟骨表面，並有保護軟骨的效用，而外生性的玻尿酸，使得廣大的巨分子糾結纏繞，造成關節液特有的黏滯堅韌性。在類風濕性及退化性關節炎病人的關節液中，玻尿酸的濃度及分子量都有下降的趨勢，推測的可能原因有：1.關節滑膜B型細胞的HMW-HA生合成有問題。2.自由基對玻尿酸進行去聚合作用 ( depolymerization )。3.接受器調控的內噬作用增加所造成的。這些使得關節液的流變特性改變，可能是關節炎疾病演化的原因之一。

三、應用關節腔注射玻尿酸治療退化性關節炎：

　　關節腔中的玻尿酸具有負責關節液的黏滯特性，可提供潤滑及緩衝撞擊的功能。此外，關節腔內的玻尿酸不但可防止蛋白聚醣 ( proteoglycans ) 由基質流失進入關節腔，維持軟骨基質的正常，也可以防止一些發炎細胞浸潤入關節腔，這種排除現象是依據蛋白的分子量，較大的分子會被排除無法進入關節液 ( 例如：α-2-macroglobulin )。當關節彎曲時，關節腔內壓力上升，玻尿酸可幫助小分子溶質及水，透過內膜微血管由關節液傳送到關節軟骨，以降低液體的流失。

　　臨床上，退化性關節炎的放射學病症是軟骨流失及纖維化，造成關節腔的窄化、硬化及骨蝕所伴隨的骨骼重建現象。一般也會發生滑膜發炎現象，而且可能是主要 驅使這疾病就診的主因。退化性關節炎病人的關節液中含有大量的發炎物質 ( inflammatory mediators )，及其他免疫細胞活化的指標性分子 ( markers )，而且血清的 C-reactive protein 濃度也升高。在退化性關節炎病人的關節液中發現玻尿酸的分子量及濃度都比健康的低，這種分子量的降低，及受到滲透的血漿及蛋白稀釋濃度，因而造成關節液的流變特性改變。因此，Balazs 與 Denlinger 等人提出黏彈性補充療法 ( viscosupplementation ) 的觀念：將已退化關節中的不正常關節液吸出，再注射純化的高分子量玻尿酸取代。這種治療的原理是回復或補充關節液的黏滯性，以改善關節的功能並減緩症狀。雖然臨床研究測試 Balazs 的假設，在減緩退化性關節炎症狀方面是成立的，但也有臨床的結果發現注射的玻尿酸分子量，若比由受損的關節所抽出的關節液中的玻尿酸還低，一樣可達到效果。然而，已知玻尿酸的半衰期小於24小時，一但注射玻尿酸，卻發現臨床療效常可維持好幾週至幾個月 ( 平均為六個月 )。到目前為止，還不清楚關節腔內注射玻尿酸產生臨床療效的作用機制，療效的評估也僅止於疼痛指數，疼痛頻率，發炎等評估。因此，藉由比較退化性關節炎治療前與治療後，關節液中分子的表現差異，也許可進一步得知玻尿酸的治療指標與可能涉及的作用機制。

四、我們在關節腔注射玻尿酸治療退化性關節炎的蛋白質體學研究：

　　關節發炎的過程牽涉許多複雜的訊息傳遞路徑。最近十年，有增加的證據顯示，許多細胞內的訊息傳遞是受到細胞內的活性氧物質 ( reactive oxygen species, ROS ) 所調控。首先我們的研究證實，罹患退化性關節炎病人的關節液中，的確有較高含量的超氧陰離子 ( O₂⁻ ) 以及過氧化氫 ( H₂O₂ )，而經關節腔注射玻尿酸治療後，該活性氧物質均可被有效調降。接著，我們希望藉由比較退化性關節炎病人治療前後的關節液蛋白圖譜表現，鑑定對玻尿酸治療有反應的蛋白質，並尋找關節腔注射玻尿酸後的療效評估分子。我們將關節液中高含量的蛋白質 ( high abundant protein ) 移除後，利用二維差異表現蛋白質電泳 ( two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE )，基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀 ( matrix-assisted laser desorption ionization time of light mass spectrometry, MALDI-TOF ) 找出人類玻尿酸治療前後關節液中差異表現的蛋白質。我們的結果顯示，病人在經過玻尿酸治療後，關節液中至少有四個蛋白質有明顯的變化，包含纖維蛋白原β鏈的分解產物 ( fibrinogen β chain degradation products )、血紅素結合蛋白 α/β 型 ( haptoglobin α/β )、血紅素β型 ( hemoglobin β ) ，及色素上皮細胞衍生因子(pigment epithelium-derived factor)。我們也利用免疫分析法，驗證退化性關節炎病人成對樣品中這些候選蛋白質的調節作用。初步的研究顯示玻尿酸可能牽涉抗發炎及抗氧化效應，目前正在釐清，這些分子是否能成為玻尿酸治療療效的評估分子。 。

　　此外，我們也發現人類軟骨細胞在過氧化氫所引起的高氧化壓力環境中培養，經加入玻尿酸可明顯增加軟骨細胞的存活率。我們推測玻尿酸極有可能藉由與細胞表面的 CD44 分子結合後，調控一系列的蛋白質表現而發揮其生理功能。我們利用蛋白質體學策略，系統性的分析在高氧化壓力下，玻尿酸所調節的蛋白質圖譜。同時，透過膠體蛋白質體 ( gel-based proteomics ) 分析平台，我們得到至少54個差異性表現蛋白質，分別參與細胞救援、保護與壓力 ( cell rescue, defense and stress )、蛋白質命運 ( protein fate )、細胞骨架結構 ( cellular organization )、蛋白質合成與替代 ( protein synthesis and turnover )、新陳代謝 ( metabolism )、能量 ( energy ) 與訊息傳遞 ( signal transduction ) 等功能，這暗示玻尿酸與抗氧化、抗發炎、調控細胞代謝與調節細胞生長有關。為了得到更完整的調節訊息，近期我們將整合利用液相定量蛋白質體 ( nongel-based quantitative proteomics ) 的分析結果，系統性的探討在軟骨細胞中受玻尿酸調節的作用分子群。以上研究將有助於我們了解玻尿酸在軟骨細胞中所扮演的角色，也將幫助我們評估玻尿酸在退化性關節炎治療與預防中的臨床應用價值。